В 1994 году Сенна перешёл из «Макларена» в «Уильямс-Рено», сильнейшую на тот момент команду. Несмотря на завоевание поул-позишн в первых двух гонках сезона — Гран-при Бразилии и Тихого океана, финишировать в них ему не удалось. При этом обе гонки выиграл Михаэль Шумахер на Бенетон-Форд, который неожиданно стал главным претендентом на титул. 1 мая 1994 года Айртон участвовал в третьей за свою новую команду гонке — Гран-при Сан-Марино. Он снова выиграл поул, но гонка закончилась для него трагически.

В течение всего уикенда, в который проходила эта гонка, постоянно случались различные неприятности, из которых наиболее серьёзными стали две. Сначала во время пятничных свободных заездов в серьёзную аварию попал Рубенс Баррикелло. Он сломал нос и ребро, оказался в больнице и не смог из-за этого участвовать в гонке. Баррикелло недавно пришёл в Формулу-1 и считался протеже Сенны. Сенна навестил Баррикелло в больнице (врачи запретили ему это делать, поэтому Айртону пришлось перелезть через стену) и после разговора с ним пришёл к выводу, что нужно пересматривать стандарты безопасности в Формуле-1. На следующий день во время субботней квалификации погиб австрийский гонщик Роланд Ратценбергер — его машина вылетела с трассы в скоростном вираже «Вильнёв» на скорости около 314 километров в час и ударилась левой стороной о железный ограничитель. Эта смерть шокировала всех, поскольку в течение предыдущих 12 лет никто из гонщиков не погибал на трассе и многие впервые переживали такой момент. Сенна ещё более уверился в том, что необходимо срочно принимать меры по повышению безопасности гонок. Утром, в воскресенье, по инициативе Сенны, состоялось собрание гонщиков, на котором они договорились создать рабочую группу по безопасности, которая занялась бы разработкой плана мероприятий. Участники этого собрания вспоминали, что Сенна вёл себя очень нервно и неуравновешенно, как будто предчувствовал что-то.

В начале гонки в первом повороте столкнулись Педро Лами и Юрки Ярви Лехто (при этом разлетевшимися обломками были ранены трое зрителей, один из них тяжело), и на трассу выпустили машину безопасности, чтобы скорость движения болидов снизилась и можно было убрать обломки. Гонщики ехали за машиной безопасности до 6-го круга. На 7-м круге, втором после ухода машины безопасности и рестарта гонки, машина Сенны сорвалась с трассы в повороте «Тамбурелло» и на огромной скорости врезалась в бетонную стену. Согласно показаниям телеметрии, в момент срыва скорость машины была около 310 километров в час, после этого Сенна успел затормозить и замедлить машину, но всё же скорость в момент удара о стену составляла примерно 218 километров в час.

Когда стало понятно, что Сенна остаётся неподвижным в машине, гонка была остановлена, к месту аварии прибыли медики. Когда Сенну достали из обломков машины, он практически не подавал признаков жизни, ему сделали трахеостомию и на вертолёте доставили в госпиталь, подключив к аппарату искусственного дыхания. После проведённого обследования стало ясно, что мозг Сенны мёртв и шансов на его выход из комы не осталось. Поэтому медики приняли решение прекратить искусственно поддерживать жизнь его тела. Как выяснилось позже, при столкновении правое переднее колесо оторвалось вместе с куском подвески и ударило Сенну по голове, при этом металлический кусок подвески пробил его шлем и нанёс смертельную травму.

По некоторым данным, смерть была вызвана переломом основания черепа в результате огромной перегрузки в момент удара. Если бы в то время использовали современные средства пассивной безопасности, которые ограничивают перемещение головы относительно плеч, то, возможно, исход аварии был бы иным.

После того как Сенну увезли в больницу, гонка была возобновлена; в ней победил Михаэль Шумахер. Некоторые медики и гонщики считают, что Сенна умер сразу же после аварии и его транспортировка в больницу была бессмысленной — организаторы гонки якобы пошли на это потому, что, объявив о смерти гонщика немедленно, было бы неэтично возобновлять гонку, и её организаторы, включая FIA, понесли бы серьёзные убытки. Эта точка зрения опровергается официальными представителями FIA и организаторами гонки. На самом деле по итальянским законам в случае гибели гонщика необходимо немедленно прекратить соревнования и закрыть автодром. Возможно, в этом и кроется истинная причина сокрытия времени смерти.

Среди экспертов до сих пор нет единства по поводу причин аварии. Высказывались самые различные версии: от недостаточного прогрева шин вследствие нескольких кругов за машиной безопасности до мгновенной потери сознания пилотом из-за высоких перегрузок. Наиболее распространённой версией, которая была признана достоверной итальянским судом, проводившим разбирательство, является неисправность рулевого управления. Рулевая колонка в болиде Сенны была искусственно удлинена посредством трубчатой вставки (рулевой вал в колонке был разрезан, и в место разреза была вставлена стальная трубка, которую обварили по краю). После аварии эта вставка оказалась сломанной по месту сварки, но произошло ли это непосредственно перед аварией (что привело к вылету болида с трассы) или она сломалась от удара — эксперты так и не сумели определить.

Существует ещё одна версия. По словам некоторых очевидцев, за несколько секунд до вылета из-под днища болида вылетали искры, что может свидетельствовать о его контакте с полотном. Если днище болида касается полотна, то часть веса машины оно берёт на себя, при этом сила сцепления покрышек резко снижается. Так как до этого покрышки успели остыть за время езды за машиной безопасности, то сцепные качества покрышек в тот момент были слишком низкими.

В рукаве его комбинезона был найден испачканный кровью австрийский флаг. По всей видимости, Сенна собирался посвятить свою победу погибшему за день до этого Ратценбергеру, хотя никому не сказал об этом. Остатки машины после судебного разбирательства были возвращены команде «Уильямс» и, согласно её заявлению, уничтожены.

Смерть Сенны стала трагедией для многих болельщиков во всём мире, и в особенности в Бразилии. Бразильское правительство объявило трёхдневный национальный траур. В день похорон Сенны в Сан-Паулу траурную процессию сопровождали несколько миллионов человек. Одним из тех, кто нёс его гроб, был давний соперник Сенны Ален Прост. Сенну похоронили на кладбище Морумби близ Сан-Паулу.