Джон Малкович родился 9 декабря 1953 года в Кристофере, штат Иллинойс. Его отец Дэниел, хорват по происхождению, издавал журнал Outdoor Illinois, а мать Джо Энн руководила местным ежедневным изданием The Benton Evening News.

В школьные годы Малкович увлекался музыкой, но пошел учиться на эколога в Восточно-Иллинойский университет. В университете он увлекся театром, поэтому решил перевестись в университет штата Иллинойс для изучения драматического искусства.

В 1976 году он окончил университет, не получив степени. Но очень скоро он обратил свой взор к театру. Когда он, в конце концов, покинул штат Иллинойс, он встретил старого приятеля Гэри Синиза, который основал театр в заброшенном подвале церковного здания. Так образовалась актерская труппа чикагского театра Steppenwolf Theatre. Малкович сыграл в более чем 50 спектаклях на протяжении шести лет.

Он блеснул в роли продажного старшего брата в «Правдивом Западе» Сэма Шепарда, в постановке режиссера Гэри Синиза, и поддержал репутацию родного театра Steppenwolf Theatre, выиграв в 1982 году престижную премию OBIE, когда пьеса была сыграна на сценах Нью-Йорка. Два года спустя Малкович повторил свой успех, став двукратным обладателем премии OBIE, на этот раз за роль в возрожденной постановке Лэнфорда Уилсона Balm in Gilead.

В кино Малкович дебютировал исполнив второстепенную роль в драме Роберта Бентона «Место в сердце» (1984). За работу в этой картине, Малкович был выдвинут на Оскар в номинации лучшая мужская роль. В этом же, 1984 году, он исполнил и одну из центральных ролей в исторической драме «Поля смерти». В дальнейшем Малкович успешно совмещает работу в кино и в театре.

В 1988 году он играет в одном из его успешных фильмов «Опасные связи». В этом же году он снялся в фильме Вольфганга Петерсена «На линии огня», за роль в котором он был второй раз номинирован на Оскар. 1988 год был плодотворный еще и тем, что Джон дебютировал как продюсер, работая над фильмом «Случайный турист».

В последующие годы Малкович снялся приблизительно в полусотне картин, завоевав своими работами любовь зрителей, признание кинокритиков и уважение со стороны коллег по кинематографическом цеху. В числе наиболее известных картин с участием актера: «О мышах и людях» (1992), «Скала Малхолланд» (1996), «Воздушная тюрьма» (1997), «Жанна д’Арк» (1999) и «Эрагон» (2006). Немалоуспешной была работа в фильме «Человек в железной маске», в котором Джен Малкович снялся с такими актерами, как Леонардо Ди Каприо, Джереми Айронс и Жерард Депардье.

Стоит отметить, что в 1999 Малкович стал героем странного и восхитительного фильма Спайка Джонза «Быть Джоном Малковичем», где он сыграл самого себя, свою предполагаемую настоящую жизнь.

Более поздние проекты включают боевик «Джона Хекс», в котором он играл вместе с Джошем Бролином и Меган Фокс, и «Чемпион» (оба 2010).

23 июня 2011 состоялась мировая премьера фильма «Трансформеры 3: Тёмная сторона Луны», в котором Малкович сыграл Брюса Бразоса.