Джулианна Маргулис родилась 8 июня 1966 года в Спринг-Вэлли, Нью-Йорк.

Была младшей из трех дочерей в семье Франчески Маргулис (Franchesca Margulies) - балерины и учительницы хореографии и Пола Маргулиса (Paul Margulies) - автора рекламных текстов. Будучи ребенком, будущая актриса вместе с семьей кочевала с места на место, проживая то во Франции, то в Нью-Йорке, то в Англии. Родители будущей актрисы были детьми еврейских иммигрантов из Восточной Европы.

Джулианна училась в школе "Green Meadow Waldorf School", а после поступила в высшую школу "High Mowing School". Еще через некоторое время она стала студенткой колледжа "Sarah Lawrence College", по окончании которого была удостоена степени бакалавра в области гуманитарных наук. После завершения учебы в колледже Джулианна поступила в нью-йоркскую студию "The Acting Studio", где познавала тонкости актёрского мастерства.

Впервые снялась в кино в фильме "Out for Justice", в котором играла проститутку. В 1994 году начинающая актриса прошла кастинг и стала сниматься в популярном телевизионном сериале "Скорая помощь". В том же году Джулиана удостоилась премии "Эмми" за лучшую женскую роль. В 2000 году актриса покинула сериал "Скорая помощь" и стала периодически играть в театре, а также снималась в незначительных эпизодах в других телевизионных фильмах.

В 2007 году актриса вышла замуж и через год родила сына.