Родился 20 мая 1908 года в Индиана, штат Пенсильвания, США. Настоящая фамилия: Мейтленд.

В 1932 году окончил архитектурный факультет Принстонского университета.

«Самый совершенный актёр-личность» — так называли в 30-е годы этого очень высокого, худого шатена с внимательными серыми глазами и застенчивой улыбкой. Им в этот период создан образ рядового американца — симпатичного, наивного, честного человека, которого стремятся использовать в своих интересах богатые и власть имущие, но, естественно, терпят поражение, ибо он наделен не только умом и практической сметкой, но и юмором.

Сын владельца лавочки скобяных товаров (когда Стюарт достиг известности, полученные им «Оскары» и другие призы гордо красовались в витрине), Джеймс заинтересовался театром еще в университете: помимо того, что он был аккордеонистом и фокусником, у него обнаружился и явный комедийный талант. Во время выступления студенческой труппы на Бродвее с пьесой «Кэрри Нейшн» (1932) Стюарт, появившись на сцене на полторы минуты, получил в награду смех и аплодисменты. Вкусив их, юноша забыл про архитектуру и целиком отдался театру. В пьесах «Снова прощай», «Все хорошие американцы», «Разделенные на тройки», «Путешествие ночью» актер был непосредствен, смешон, обладал собственным неповторимым обаянием. Казалось, этот человек самой природой создан для кинематографа и тот не замедлил им заинтересоваться.

Стюарт дебютировал на экране в 1935 году в роли полицейского репортёра в фильме «Специалист по убийствам». Но ему потребовалось пять лет и пятнадцать фильмов, чтобы добиться настоящего успеха. Он пришел с картинами Фрэнка Капры «Этого вам с собой не унести» (1938), «Мистер Смит едет в Вашингтон» (1939) (в нашем прокате — «Сенатор»), «Жизнь чудесна» (1947). С помощью этого режиссера актер создал прославивший его образ рядового человека, родившегося в маленьком городке, от законопослушных родителей, упорного и настойчивого ходатая за интересы таких же, как он, ничем не выдающихся людей. «Необычно обычным» окрестила его пресса. Джеймс варьировал этот имидж в разных жанрах: мелодраме «Созданные друг для друга» (1939), вестерне «Дестри снова в седле» (1940), комедии «Не время шутить» (1940) и др. У Стюарта был свой стиль игры: шероховатый, неровный, нервный, где сентиментальность постоянно прослаивалась комизмом. Запинающаяся речь, застенчивая манера общения свидетельствовали о том, что он не какой-то там светский шаркун, нахал и эгоист, а человек, хотя и ершистый, но положительный. Именно за такую роль Джеймс получил «Оскара» в «Филадельфийской истории» (1940), обойдя при этом центрального исполнителя Кэри Гранта.

В годы войны Стюарт стал первой кинозвездой, ушедшей добровольцем в армию, хотя его заработок упал при этом с 12 тысяч долларов в месяц до двадцати одного (столько получал рядовой). Поскольку Джеймс умел управлять самолетом (у него давно был собственный), его зачислили в военно-воздушные силы, где он к сентябрю 1945 года стал полковником с многими наградами. Оставаясь в резерве и всячески сотрудничая с военной авиацией, актёр дослужился в ней до чина бригадного генерала.

С конца 40-х Джеймс начал отходить от привычного образа, пробуя себя в разных амплуа, в том числе и отрицательных героев: циничного репортёра в «Звоните Нортсайд 777» (1948), учителя убийцы в «Веревке» (1948), контрабандиста в «Ма-лайе» (1950), пьяницы в «Гарви» (1950).

В 50-е актёр нередко выступал в «новом» вестерне в ролях умудренных жизнью людей, далеких от идеальности, но по сути своей — неплохих. («Винчестер 73», 1950; «Сломанная стрела», 1950; «Поворот реки», 1952; «Далёкая страна», 1955; «Человек из Ларами», 1955; «Человек, который убил Либерти Вэланса», 1962.) Потом пошла серия популярных биографий: «История Глена Миллера» (1954), лётчика Чарлза Линдберга в «Духе Св. Луи» (1957), гангстерского босса, изобретателя 30-калиберной винтовки в «Карабине Уильямса» (1952) и др.

Наибольших достижений актёр достиг в триллерах Альфреда Хичкока: «Окно во двор» (1945), «Человек, который слишком много знал» (1956), «Головокружение» (1958). За роль адвоката на процессе армейского офицера в «Анатомии убийства» Отто Преминджера (1959) был в пятый раз выдвинут на «Оскара», но получил премию Венецианского МКФ и нью-йоркских критиков. В 60-е—70-е особых успехов на экране у него уже не было. Роли повторяли сыгранные ранее или вообще он появлялся лишь в эпизодах. Необходимость зарабатывать деньги у Стюарта отсутствовала, ибо долгая работа в кино сделала его мультимиллионером. К тому же он первый ещё в 1940 году ввёл в свою актёрскую практику получение — дополнительно к гонорару — процента с прибыли от показа картины. А так как фильмы с его участием неизменно пользовались успехом, то количество получаемых долларов росло и росло.

Женился Джеймс поздно — в 41 год — на Глории МакЛин, с которой счастлив вот уже четыре десятилетия. Помимо двух мальчиков — её детей от первого брака, супруги вырастили собственных девочек-близнецов, родившихся в 1951 году. Этот «почти самый нормальный из голливудских звёзд», как ядовито заметила когда-то обозревательница Лоуэлла Парсонс, увлекается фотографией, любит гольф, рыбную ловлю, пикники.

Не только на экране, но и в жизни Стюарт остается тем, с кем зрители хотели бы идентифицировать себя в жестоком и циничном мире.

80-е годы увенчали долгую экранную жизнь актёра вереницей премий. В 1980 году её вручил Американский киноинститут. В 1984 году он получил «Оскара». В 1985 году ему был присужден специальный приз 38 МКФ в Канне. В 1987 году о нём сняли телевизионный документальный фильм «Джеймс Стюарт — прекрасная жизнь».

Ушёл из жизни 2 июля 1997 года в Лос-Анджелесе.